Presencia de Acanthamoeba en muestras ambientales de la provincia de Mendoza. Identificación por Caracterización Morfológica y confirmación por técnica de PCR.

Lucchesi, O ; Santos, G ; Tonelli, R ; Jercic Lara, M ; Carrizo , LC ; Salomón, MC

Postulado a premio Inv. Joven en Inv. Clínica

Introducción.

Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos anfizoicos ampliamente distribuidos en la naturaleza. Algunas son de importancia médica como agentes causantes de infecciones en el hombre y animales.

El género Acanthamoeba ha sido aislado a partir de una amplia variedad de hábitats tales como aire, suelo y agua (1). Su presencia en agua de ríos, lagos, abasto público y piscinas representa un riesgo para la salud ya que el contacto con éstas fuentes es la principal vía de infección (2).

La queratitis acanthamebiana (QA) es una infección invasiva de la córnea, caracterizada por una pérdida gradual de la agudeza visual, pudiendo llegar a provocar ceguera. El desarrollo de esta enfermedad está frecuentemente asociado a usuarios de lentes de contacto, debido a que las amebas proliferan en las soluciones oftálmicas o en los recipientes de las lentes y son transferidas a la superficie corneal al ser insertada la lente (3). Algunos casos están asociados a lesiones oculares con posterior exposición a agua o tierra contaminada y, generalmente, están relacionados al desarrollo de actividades laborales en ambientes rurales o la práctica de actividades deportivas acuáticas (4).

La incidencia de QA ha aumentado en los últimos años. En Mendoza, el primer caso fue reportado por el Hospital Central  en el 2003 (5). Al presente, hemos diagnosticado morfológicamente 16 casos a partir del cultivo  de biopsias corneales. Uno asociado a traumatismo ocular y el resto al uso de lentes de contacto, desconociéndose en todos, la especie involucrada y la fuente de contaminación.

La amplia distribución de estas amebas y la gran variedad de especies asociadas a infecciones, genera la necesidad de profundizar la búsqueda ambiental de los diversos nichos ecológicos de Acanthamoeba, para definir estos hábitats desconocidos, pero potencialmente peligrosos. Asimismo, debido a las similitudes morfológicas que existen entre los diferentes géneros de AVL, consideramos de vital importancia el desarrollo e implementación de métodos moleculares que confieran mayor especificidad y sensibilidad al diagnóstico.

 

Objetivos.

Nos propusimos aislar e identificar morfológicamente Acanthamoeba spp. mediante cultivo de muestras obtenidas de diversas fuentes ambientales de Mendoza y confirmar dicha identificación por PCR para, de esta forma, establecer las  potenciales fuentes de infección.

 

Metodología.

1. Muestras ambientales: Se recolectaron un total de 100 muestras a partir de ambientes terrestres y acuáticos relacionados con el desarrollo de actividades laborales y deportivas. Al presente han sido analizadas 25 de suelo y 25 de agua.

2. Concentración de muestras: Las muestras de suelo fueron concentradas por el método de Telemann  modificado y las de agua mediante decantación y centrifugación.

3. Cultivo xénico de Acanthamoeba: Los sedimentos obtenidos se sembraron en agar no nutritivo al 1,5%, suplementado con Escherichia coli. Los quistes y/o trofozoítos fueron observados en MO (100 y 400X).

4. Cultivo axénico: Las amebas desarrolladas en cultivo xénico, fueron transferidas a  medio YPG con antibióticos.

5. Coloración de Gram: Se realizó para evidenciar quistes y/o trofozoítos en los cultivos positivos.

6. Lisis celular y extracción de DNA: Los cultivos fueron concentrados por centrifugación y las células lisadas en buffer UNSET. El ADN se extrajo con la mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1).

7. Amplificación por PCR: Se amplificó un fragmento del gen del ADNr 18S de Acanthamoeba con el set de primers JDP1/JDP2 específicos para Acanthamoeba spp. Control positivo: cepa de Acanthamoeba genotipo T4; controles negativos: ADN del hongo Botritis cinerea y ADN de vid.

 

Resultados.

1. A partir de la caracterización morfológica de las 50 muestras sembradas, fue observado el desarrollo de protozoos compatibles con Acanthamoeba en 14 muestras de agua y 4 de suelo (Imagen 1).

2. En concordancia con los hallazgos morfológicos, la PCR permitió confirmar la identificación de los aislamientos correspondientes al género Acanthamoeba. A partir de las 14 muestras de agua y las 4 muestras de suelo en las que fue caracterizado morfológicamente el parásito, se obtuvo el amplicón correspondiente al fragmento ASA.S1 de alrededor 500 pb (Imagen 2). Mientras que, no se obtuvo amplímero en las muestras en las que no fueron  observados elementos  parasitarios compatibles con Acanthamoeba.

3. Los porcentajes relativos de hallazgos de Acanthamoeba spp. en muestras ambientales fueron del 56% en agua (14/25) (Imagen 3a) y 16% en suelo (4/25) (Imagen 4a). El parásito fue identificado en el 90% de las muestras de agua riego (9/10), el 40% de las muestras de pileta (2/5) y el 30% de las muestras de agua corriente (3/10) (Imagen 3b). En las muestras de suelo, el 23% de los hallazgos correspondió a superficie (3/13) y el 8.3% a profundidad (1/12) (Imagen 4b).

 

Conclusiones.

    Nuestros resultados permiten inferir que el medio ambiente de  Mendoza constituye una fuente de infección por Acanthamoeba spp. dado que hemos demostrado la presencia de este parásito tanto en agua como en suelo.

            Según los porcentajes de hallazgos ambientales de Acanthamoeba, podemos concluir que el agua posee un mayor potencial infeccioso respecto del suelo. Además, es importante destacar que los hallazgos en piletas de natación representan un mayor riesgo de infección por este parásito debido a que existe un contacto más estrecho del hombre con estas fuentes.

            Por otra parte, la aplicación de la técnica de PCR provee una herramienta complementaria que permite confirmar la identificación de Acanthamoeba realizada mediante caracterización morfológica, proporcionando una mayor  sensibilidad y especificidad a la detección del parásito.

 

Bibliografía.

1. Tsvetkova N y col. 2004. The identification of free-living environmental isolates of amoebae from Bulgaria. Parasitol. Res. 92(5):405–413.

2. Vesalouma M y col. 1995. Microbiological quality in Finnish public swimming pools and whirlpools with special reference to free living amoebae: a risk factor for contact lens wearers? Br. J. Ophthalmol. 79: 178-181.

3. Cruz M y col. 2004. Estudio clínico-microbiológico de tres casos de queratitis por Acanthamoeba spp. Enf. Emerg. 6(2):98-102.

4. Radford C y col. 1998. Acanthamoeba keratitis: multicentre survey in England 1992-6. National Acanthamoeba Keratitis Study Group. Br. J. Ophthalmol. 82(12):1387-1392.

5.  Lofti A y col. 2005. Reporte de la Primera Queratitis por Acanthamoeba sp. en el Servicio de Oftalmología, Hospital Central Mendoza, Argentina. ABCL, suplemento 3.

 

Imagen 1

Caracterización Morfológica de Acanthamoeba en muestras ambientales. A: N° de hallazgos en el total de muestras analizadas B: MO de frescos y tinción de Gram de quistes (1 y 2) y trofozoítos (3 y 4) de Acanthamoeba spp. 1 y 2: doble pared quística (flecha), 3: vacuola contráctil (vc), 4: acanthopodo.

Imagen 2

Confirmación de la identificación morfológica de Acanthamoeba spp. mediante PCR. Carriles 1: control positivo: cepa de Acanthamoeba T4, 2: control negativo de PCR, 3: ADN de Botrytis cinerea, 4: ADN de vid, 5 y 7: agua pileta, 6: agua corriente, 8 y 9: agua de riego, 10 y 11: tierra superficie, 12: tierra profundidad.

Imagen 3

Frecuencia de hallazgos de Acanthamoeba en agua de la provincia de Mendoza. A: Porcentaje relativo de hallazgos en el total de muestras analizadas B: Frecuencia de hallazgos en diferentes tipos de muestras de agua.

Imagen 4

Frecuencia de hallazgos de Acanthamoeba en suelos de la provincia de Mendoza. A: Porcentaje relativo de hallazgos en el total de muestras analizadas. B: Frecuencia de hallazgos en diferentes tipos de muestras de suelo.